全基因組甲基化測序WGBS

WGBS, Whole Genome MethylC equencing

產品簡介

iGeneTech™全基因組甲基化測序(WGBS, Whole Genome Bisulfite Sequencing) 是將重亞硫酸鹽處理與Illumina HiSeq系列平臺高通量測序相結合, 研究全基因組范圍內的精確甲基化的整體解決方案。iGeneTech™采用MethylC-Seq方向性(directional)建庫方法更加精準的繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜, 被應用于研究物種特定DNA區域甲基化與特定表型之間的關聯。

穩定高效的項目流程,21個工作日快速交付;

Lamda DNA陽性質控,亞硫酸鹽翻轉效率>98%, 定制iGeneTechTM酶極大提高擴增效率,增強文庫制備的穩定性;

對全基因組5mC信息進行高效掃描,保證數據精度和質量,一般樣本100G raw data,Q30不低于80%;

多樣本的覆蓋區域重復性高,適用于多樣本間的差異分析。

應用領域

醫學
醫學:闡釋疾病的發生發展機制,發現與疾病相關的生物標志物,以應用于疾病診斷、治療、預后及用藥研究。
動植物
動植物:動植物生長發育、抗病、抗逆機制研究以及育種研究。同時可實時更新和補充關聯信息的完整性

服務流程

案例介紹

研究目的:基于全基因組重亞硫酸鹽測序深入研究結腸癌中的甲基化 。

研究方法:利用全基因組重亞硫酸鹽測序,比較原發性結腸癌和鄰近正常結腸組織在全基因組單堿基水平的甲基化差異。

部分結論:與鄰近正常結腸組織相比,結腸癌中通常具有低甲基化的PMDs區域(部分甲基化區域)。 在PMDs區域,高甲基化焦點區和大范圍的低甲基化區域 (>100 kb) 密切相關,與核纖層相關結構域一致 。

樣品要求

樣品類型 樣品規格 樣品采集/運輸
DNA(新鮮/冰凍樣品) >1.0μg,濃度>20ng/μl 干冰運輸
血液(全血) >1ml EDTA抗凝,2-8 °C冷藏運輸
新鮮組織 >2g 低于-20 °C(干冰)冷凍運輸
唾液 >1ml 唾液保存液混合可室溫運輸,直接收集唾液需冷凍運輸
CtDNA >1ml 要求血漿,干冰運輸
DNA(取自FFPE) >1.5μ,濃度>20ng/μl 干冰運輸
細胞 >8×10 6 去除培養液,PBS清洗1次后液氮速凍,干冰運輸
石蠟切片 >5片 10×10mm面積,常溫運輸,穿刺組織>10片
石蠟包埋塊 >1塊 不小于1×1×1mm常溫運輸
單細胞 >8×106 液氮速凍,干冰運輸

常見問題

1. DNA甲基化測序有哪幾種方法?

答:目前DNA甲基化測序的主要有WGMS、MeDIP與RRBS. WGMS是全基因組、單堿基分辨率、絕對甲基化水平檢測的方法,是DNA甲基化檢測的金標準。MeDIP是基于5mC特異性抗體去富集帶有5甲基化修飾的胞嘧啶的DNA片段, 也是全基因組覆蓋,但無法實現單堿基分辨率(分辨率為150bp左右),只能通過富集peak來判斷某一段區域是否存在甲基化,無法得到絕對的甲基化水平, 因此適合于樣本間的相對比較。RRBS是簡化的、具有代表性的亞硫酸鹽測序,通過MspI酶切基因組,選取小片段DNA進行亞硫酸鹽處理后上機測序, 以人類為例大約能測得CpG島40%的CpG、promoter 20%的CpG. iGeneTech™提供以上3種主流的DNA甲基化測序服務。

2. DNA甲基化測序如何選擇合適的測序方法?

答:普通WGMS與MeDIP是指全基因組水平上的測序,RRBS則是選擇了甲基化程度較高的區域進行測序。 在測序精確度方面,WGMS與RRBS可精確到單個堿基,而MeDIP只精確到100bp左右的甲基化區域,客戶可根據自己的研究目的和經費情況選擇合適的測序方法。

3. DNA甲基化測序如何選擇合適的測序深度?

答:WGMS是對被測樣品進行全基因組DNA甲基化的檢測,為了得到每個C的準確甲基化水平, 一般推薦每個位置的測序深度20×以上。因此,建議檢測至少30倍于物種基因組size的raw data.

4. 為什么WGMS所得的raw data 產量和Q30比例較全基因組重測序的低?

答:哺乳動物基因組中C的平均甲基化水平約為3%,CpG的平均甲基化水平50%-80%不等。用WGMS技術得到的DNA中,絕大部分的C均轉化為U,在測序過程中呈現為T. 因此,WGMS文庫屬于堿基極度不平衡(read1中C含量極低、read2中G含量極低)的類型, Illumina 測序儀在cluster 定位過程中會過濾較高比例的cluster,使得raw data產量降低;另外由于GC含量較極端,SBS過程中質量值也較容易下降。

5. WGMS的原理是什么?

答:亞硫酸鹽處理(Bisulfite Treatment)測序是DNA甲基化檢測的金標準。非甲基化C在bisulfite treatment后,會變成U;而甲基化C在bisulfite treatment后能保持不變。隨后經過PCR擴增過程中,U被T取代, 我們可以通過判斷C是否變成T來判斷該C是否有甲基化修飾。利用二代測序,我們可以對整個被測基因組進行DNA甲基化的測序。

6. 亞硫酸鹽處理后非甲基化C轉化成U的轉化率如何評估?

答:iGeneTech™選用沒有甲基化修飾的Lambda DNA作為外標,以質量比1%的量摻入被測基因組DNA,共同進行WGMS的文庫制備。測序完成后,通過與Lambda DNA的參考基因組進行比對,統計Lambda DNA的平均甲基化水平, 最后得出亞硫酸鹽處理后非甲基化C轉化成U的轉化率(100%減去Lambda DNA平均甲基化水平)。 iGeneTech™承諾WGMS的亞硫酸鹽處理后非甲基化C轉化成U的轉化率高于99%.

7. WGMS采用哪種建庫方法,有什么特點?

答:iGeneTech™ WGMS采用MethylC-Seq方向性(directional) 建庫方法,其測序結果只有兩條original reads,分別為Bisulfite Watson (BSW) 或 BisulfiteCrick (BSC) . 因此,在進行reads比對時,BSW和BSC只需要分別與C-T轉換和G-A轉換的參考基因組進行比對即可。 而一般所使用的BS-Seq為非方向性(non-directional)的建庫方法,測序結果包括四條reads, 即 BSW、 BSC以及它們分別的互補鏈(complementary reads,BSWRC和BSCRC)。 因此,在進行reads比對時,需要進行四次比對。MethylC-Seq相比于BS-Seq,具有較高的唯一比對率,并減少了數據比對的時間。 iGeneTech™采用的正是MethylC-Seq.

8. 全基因組甲基化測序中哪些因素會影響測序結果?

答:樣品DNA的長度、亞硫酸鹽翻轉處理過程、擴增的效率、測序深度和覆蓋度等因素都可能會影響到實驗結果。