簡化甲基化測序RRBS

RRBS, Reduced Representation Bisulfite Sequencing

產品簡介

iGeneTech™簡化甲基化測序(RRBS, Reduced Representation Bisulfite Sequencing)是利用限制性內切酶對基因組進行酶切, 富集啟動子及CpG島區域,進行硫化處理及片段富集并制備高質量文庫,之后使用Illumina HiSeq系列平臺進行高通量測序的整體解決方案。

穩定高效的項目流程,21個工作日快速交付;

多樣本的覆蓋區域重復性高,適用于多樣本間的差異分析;

數據質量保證,5G clean data,Q30不低于80%;

Lamda DNA陽性質控,亞硫酸鹽翻轉效率>98%, 定制iGeneTechTM酶極大提高擴增效率,提高文庫制備的穩定性。

應用領域

醫學
醫學:闡釋疾病的發生發展機制,發現與疾病相關的生物標志物,以應用于疾病診斷、治療、預后及用藥研究。
動植物
動植物:動植物生長發育、抗病、抗逆機制研究以及育種研究。同時可實時更新和補充關聯信息的完整性

服務流程

案例介紹

研究目的:探究甲基化導致的RRAD(與糖尿病有聯系的ras相關蛋白)基因失活與腫瘤發生的關系 。

研究方法:通過簡化甲基化重亞硫酸鹽測序(reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)和數字基因表達兩種方法, 比較T29H(人類卵巢上皮細胞系RasV12基因轉化細胞系)和T29(永生非轉化細胞系)在Ras調控的轉錄組和表觀遺傳方面的差異。

部分結論:RasV12基因調控的致癌性轉化伴隨有RRAD啟動子高度甲基化和RRAD表達缺失。通過基因敲除和過表達技術,發現RRAD通過抑制葡萄糖轉座子的表達,抑制了葡萄糖攝取和乳酸鹽的產生;RRAD在T29H的過表達抑制了裸鼠模型腫瘤的形成,表明RRAD是一個腫瘤抑制基因。推測,RasV12基因調控的致癌性轉化誘發了RRAD表觀遺傳失活,從而促進了葡萄糖的攝取,可能導致卵巢癌的發生。

樣品要求

樣品類型 樣品規格 樣品采集/運輸
DNA(新鮮/冰凍樣品) >1.0μg,濃度>20ng/μl 干冰運輸
血液(全血) >1ml EDTA抗凝,2-8 °C冷藏運輸
新鮮組織 >2g 低于-20 °C(干冰)冷凍運輸
唾液 >1ml 唾液保存液混合可室溫運輸,直接收集唾液需冷凍運輸
CtDNA >1ml 要求血漿,干冰運輸
DNA(取自FFPE) >1.5μ,濃度>20ng/μl 干冰運輸
細胞 >8×10 6 去除培養液,PBS清洗1次后液氮速凍,干冰運輸
石蠟切片 >5片 10×10mm面積,常溫運輸,穿刺組織>10片
石蠟包埋塊 >1塊 不小于1×1×1mm常溫運輸
單細胞 >8×106 液氮速凍,干冰運輸

常見問題

1. DNA甲基化測序有哪幾種方法?

答:目前DNA甲基化測序的主要有WGMS、MeDIP與RRBS. WGMS是全基因組、單堿基分辨率、絕對甲基化水平檢測的方法, 是DNA甲基化檢測的金標準。MeDIP是基于5mC特異性抗體去富集帶有5甲基化修飾的胞嘧啶的DNA片段,也是全基因組覆蓋, 但無法實現單堿基分辨率(分辨率為150bp左右),只能通過富集peak來判斷某一段區域是否存在甲基化,無法得到絕對的甲基化水平, 因此適合于樣本間的相對比較。RRBS是簡化的、具有代表性的亞硫酸鹽測序 通過MspI酶切基因組,選取小片段DNA進行亞硫酸鹽處理后上機測序,以人類為例大約能測得CpG島40%的CpG、promoter 20%的CpG. iGeneTech™提供以上3種主流的DNA甲基化測序服務。

2. DNA甲基化測序如何選擇合適的測序方法?

答:普通WGMS與MeDIP是指全基因組水平上的測序, RRBS則是選擇了甲基化程度較高的區域進行測序。 在測序精確度方面,WGMS與RRBS可精確到單個堿基,而MeDIP只精確到100bp左右的甲基化區域,客戶可根據自己的研究目的和經費情況選擇合適的測序方法。

3. RRBS為何要求基因組DNA完整度高?

答:RRBS是利用限制性內切酶MspI對基因組進行酶切后, 再對特定大?。ㄒ匀祟悶槔x取40-220bp)的DNA片段進行膠回收。 因此,當基因組DNA不完整時,會有大量的非酶切區域被回收,最終導致測序結果中有效數據量偏低。

4. 如何預估RRBS對被測物種基因組的理論覆蓋度?

答:可利用MspI的識別位點CCGG,對被測物種基因組進行模擬酶切,再對特定大小的酶切片段進行注釋,統計總的區域大小、區域中CpG的數量及在基因組中所有CpG的占比、所覆蓋CpG的數量及在不同基因元件(promoter、CGI等)中所有CpG的占比。 iGeneTech™會提供常見模式物種的模擬酶切統計結果供參考。

5. RRBS是否同樣需要關注亞硫酸鹽處理后非甲基化C轉化成U的轉化率?

答:是的,iGeneTech™在進行RRBS時, 同樣會摻入一定比例的非甲基化Lambda DNA. iGeneTech™承諾RRBS測序結果中比對到Lambda DNA的亞硫酸鹽處理后非甲基化C轉化成U的轉化率高于99%。

6. iGeneTech™是否提供痕量的基因組DNA起始的RRBS測序?

答:是的,iGeneTech™對痕量起始的RRBS建庫具有豐富的經驗,并提供定量化的RRBS技術(Q-RRBS)。此類項目的服務需特殊定制。